پیشرفت اپی‌ژنتیکی و فرار اولیه ایمنی در تکامل سرطان روده بزرگ

موضوعات

• سرطان
• اپی‌ژنومیک
• سرطان دستگاه گوارش
• اطلاعات ژنومیک

چکیده

کنترل سیستم ایمنی یک مانع اساسی در تکامل سرطان است. دینامیک‌های زمانی فرار ایمنی به‌طور کامل توصیف نشده‌اند و هنوز روشن نیست که انتخاب مبتنی بر ایمنی چگونه با تغییرات اپی‌ژنوم در ارتباط است. در اینجا ما دینامیک‌های تکاملی مبتنی بر ژنوم و اپی‌ژنوم که هماهنگی تکامل تومور‑ایمنی را در سرطان‌های روده بزرگ (CRC) اولیه شکل می‌دهند، بازسازی می‌کنیم. ما از یک مجموعه داده چندمنطقه‌ای چنداومیک شامل پروفایل‌های متقارن ژنوم، ترانسکریپتوم و دسترسی به کروماتین از ۴۹۵ غده تک‌تکه (از ۲۹ CRC) استفاده می‌کنیم که با داده‌های توالی‑یابی نوآنتی‌ژن با وضوح فضایی بالا و تصویر‌برداری چندپاره میکرومحیط تومور از ۸۲ میکروبسی در ۱۱ CRC تکمیل می‌شود. تغییرات دسترسی به کروماتین سوماتیک به از دست رفتن دسترسی به ژن‌های ارائه‌کننده آنتیژن و ساکن‌سازی نوآنتیژن‌ها منجر می‌شود. فرار و حذف ایمنی از همان ابتدا در شکل‌گیری CRC رخ می‌دهد و تفاوت‌های داخل‑توموری در ویرایش ایمونولوژیک در مراحل بعدی عملاً ناچیز یا محدود به مکان‌های تهاجمی است. به‌طور کلی، فرار ایمنی در CRC الگوی تکاملی «انفجار بزرگ» را دنبال می‌کند؛ به‌گونه‌ای که نزدیک به تبدیل رخ می‌دهد و تکامل بعدی سرطان‑ایمنی را تعیین می‌کند.

متن اصلی

تومورها به‌طور مداوم توسط تعاملاتشان با محیط، به‌ویژه «جنگ» مستمر با سیستم ایمنی، شکل می‌گیرند. نوآنتیژن‌ها—پپتیدهای جدید ناشی از جهش‌های سوماتیک—می‌توانند شناسایی ایمنی را تحریک کنند، اما در نهایت تومورها با ویرایش ایمنی (از دست رفتن جهش‌های آنتی‌ژنی)، فرار ایمنی (مثلاً تضعیف ارائه آنتیژن)، حذف ایمنی (دست‌کاری در میکرومحیط تومور برای محدود کردن حضور ایمنی) یا ترکیبی از این مکانیزم‌ها از حذف ایمنی فرار می‌کنند¹. فرار ایمنی احتمالاً ویژگی دودویی روشن/خاموش نیست، بلکه فنوتیپی پیوسته است که توسط شدت مشارکت این عوامل تنظیم می‌شود. ایمونوتراپی‌ها هدفشان دوباره به کارگیری سیستم ایمنی در «جنگ» آن با سرطان است؛ بنابراین، درک مکانیزم‌های پایه‌ای فرار ایمنی برای موفقیت درمانی بسیار مهم است.

سرطان‌های روده بزرگ (CRC) به‌طور کلی میکرومحیط ایمنی نسبتاً فعالی با حضور قابل‌ملاحظه لنفوسیت‌های نفوذی به تومور دارند². حدود ۱۵٪ از CRCها نقص در تعمیر ناسازگاری (MMR) (MMRd) دارند که با بار نوآنتیژن بالاتر، حضور ایمنی تقویت‌شده^3,4 و پاسخ خوب به بلوک‌کننده‌های نقاط بررسی ایمنی (ICB) مرتبط است؛ اما تا ۳۰٪ از CRCهای MMRd به این درمان‌ها پاسخ نمی‌دهند⁵. CRCهای مبتنی بر MMR (MMRp) بار جهش کمتری نسبت به CRCهای MMRd دارند و درمان‌های ICB غیرمؤثرند⁶، که نشان می‌دهد فرار ایمنی در تومورهای MMRp احتمالاً از طریق مکانیزم‌های جایگزین برای داروهای ICB فعلی رخ می‌دهد. با این حال، نفوذ ایمنی پیش‌آگهی برای CRC است⁷، که نقش مرکزی سیستم ایمنی در تکامل CRC را نشان می‌دهد. در واقع، اکثر سرطان‌های MMRp شامل (چندین) جهش‌های نوآنتیژن کلونال احتمالی هستند⁸ و اگرچه تنها زیرمجموعه‌ای از این‌ها ممکن است به‌طور کافی ارائه شوند⁹، اما هنوز قادر به فعال‌سازی سلول‌های T هستند^10,11,12.

فرار ایمنی از طریق روش‌های ژنتیکی (مثلاً جهش‌هایی که شناسایی ایمنی نوآنتیژن‌ها را مانع می‌شوند) در CRCها رایج است^4,13. مدل‌سازی ریاضی پیشین ما نشان داد که فرار برای توسعه CRCهای MMRd اساسی است و گامی حیاتی در تشکیل CRCهای MMRp وقتی نظارت ایمنی شدید باشد، محسوب می‌شود^4,8,14. نقش اپی‌ژنوم در تنظیم آنتی‌ژنیسیته تومور کمتر مورد توجه قرار گرفته است: تغییرات سوماتیک در سازماندهی کروماتین به‌عنوان عامل تغییر فنوتیپ ایمونولوژیکی سرطان شناخته شده‌اند، اما تأثیر آن‌ها بر فرار و ویرایش ایمنی به‌طور کامل ارزیابی نشده است^15,16,17. در مطالعات پیشگام از کنسورشیم TRACERx^18,19، هایپرمتیلاسیون پروموتر به‌عنوان مکانیزم ساکن‌سازی نوآنتیژن در سرطان ریه شناسایی شد²⁰. به‌طرز مشابه، بسته شدن کروماتین می‌تواند به سرکوب بیان آنتیژن منجر شود، به این معنا که انتخاب ایمنی می‌تواند ساختار اپی‌ژنومیک یک سرطان را به‌طور قوی شکل دهد.

تحلیل‌های قبلی بر داده‌های توالی‌‏یابی عمده از تومورهای سطحی تکیه کرده بودند، بنابراین احتمالاً قادر به کشف دینامیک‌های تکاملی ایمنی کلونال و ناهمگن نبودند که می‌توانستند با گسترش بیماری مرتبط باشند. علاوه بر این، حاشیه تهاجمی—منطقه سرطانی که مستقیماً با بافت نرمال در تماس است—احتمالاً تعیین‌کننده اصلی کل فرار/حذف ایمنی است، اما به‌دلیل این که عموماً برای مقاصد تشخیصی ثابت می‌شود و برای پژوهش در دسترس نیست، به‌ندرت مستقیماً مطالعه شده است^21,22. به‌طور خلاصه، ناهمگنی فضایی در ویرایش ایمونولوژیک و فرار در CRC هنوز به‌طور کامل توصیف نشده است.

در اینجا ما تعامل بین فرار ایمنی و اپی‌ژنوم را بررسی می‌کنیم و نقش معماری کروماتین در سرکوب بیان نوآنتیژن‌ها و ماشین‌آلات ارائه آنتیژن در CRC را برجسته می‌سازیم. ما فرار ایمنی (بازسازی میکرومحیط و فرار ژنتیکی ایمنی) را در سطح غده تک‌تکه تومور توصیف می‌کنیم و ناهمگنی داخل‑توموری را در زمینه‌های مورفولوژیکی مختلف بررسی می‌کنیم. ما از توالی‌‏یابی چندمنطقه‌ای چنداومیک (ژنوم، ترانسکریپتوم و پروفایل دسترسی به کروماتین) شامل ۴۹۵ غده تک‌تکه (نمایانگر ۲۹ CRC) در مطالعه پیش‌بینی‌های تکاملی در سرطان روده بزرگ (EPICC) بهره می‌بریم^15,23. این مجموعه داده با داده‌های جدیدی تکمیل شد که ترکیبی از توالی‌‏یابی هدایت‌شده نوآنتیژن و پروفایل‌سازی بسیار چندپاره میکرومحیط تومور (TME) از ۸۲ میکروبسی نمایانگر نواحی مختلف مرتبط با تومور از زیرمجموعه‌ای از ۱۱ مورد EPICC است، که شامل متاستازهای گره لیمفاوی و مخاط نرمال دوردست می‌شود.

a، نمای کلی جمع‌آوری نمونه (وسط)، پردازش و تحلیل بیوپسی‌های FF (چپ) و FFPE (راست). b، بار نوآنتیژن، بار جهش‌های هم‌معنی، dNdS ایمنی و نمای کلی جهش‌های فرار ایمنی برای تمام نمونه‌های FF‑WGS، مرتب شده بر اساس متوسط بار نوآنتیژن و وضعیت MMR. نوارهای خطا بازه اطمینان برای برآوردهای dNdS ایمنی را نشان می‌دهند که در ۳٫۵ قطع شده‌اند. c، بار نوآنتیژن، dNdS ایمنی و نمای کلی نفوذ ایمنی برای تمام نمونه‌های FFPE‑PS، مرتب شده بر اساس متوسط بار نوآنتیژن.

نتایج

تحلیل چندوجهی ایمنی میکروبسی‌های CRC

ما چشم‌انداز ایمنی ۲۹ CRC را با وضوح غده تک‌تکه تومور، با استفاده از داده‌های چنداومیک (توالی‌‏یابی کل‌ژنوم (WGS)، توالی‌‏یابی RNA (RNA‑seq) و آزمون دسترسی به کروماتین توسط توالی‌‏یابی (ATAC‑seq)) برای غده‌های تازه‑منجمد (FF) تک‌تکه، همراه با پنل توالی‌‏یابی عمیق (PS) و ایمونوفلورسانس دوره‌ای²⁴ (CyCIF) از بیوپسی‌های فۆرمالین‑فیکس شده (FFPE) تجزیه و تحلیل کردیم. جمع‌آوری و پردازش نمونه‌های FF در منابع قبلی توصیف شده است^15,23 (شکل 1a). ما بلوک‌های FFPE تشخیصی را از ۱۱ بیمار با CRCهای MMRp مرحله III و متاستاز گره لیمفاوی به‌دست آوردیم. نواحی کوچک نمایانگر تومور سطحی، حاشیه تهاجمی و رسوبات گره لیمفاوی (شکل 1a) میکروسکشن شد و نواحی ژنومی مرتبط با ایمونوپپتیدوم توالی‌‏یابی شد²⁵ (روش‌ها). در زیرمجموعه‌ای از این نواحی، ۲۲ پروتئین که انواع سلول‌های ایمنی یا بیان گیرنده‌های تنظیمی را شناسایی می‌کردند (جدول تکمیلی 2) با استفاده از CyCIF (روش‌ها) تصویربرداری شد. در مجموع، داده‌های توالی‌‏یابی از مجموعاً ۴۹۵ غده FF و ۸۲ غده FFPE از ۲۹ بیمار (میانگین ۱۵ غده FF و هشت غده FFPE به ازای هر بیمار) با تحلیل همزمان CyCIF برای هشت بیمار ترکیب شد.

تنظیم اپی‌ژنتیکی ارائه آنتیژن

ما پیشتر نشان دادیم که تغییرات دسترسی به کروماتین سوماتیک (SCAAها) موجب بازآرایی سراسری اتصال فاکتورهای رونویسی (TF) می‌شود که سیگنال‌دهی اینترفرون را تغییر می‌دهد، که این نشان می‌دهد سیگنال‌دهی ایمنی از طریق تنظیم اپی‌ژنتیک سرکوب می‌شود¹⁵. بنابراین نقش اپی‌ژنوم را در تسهیل فرار ایمنی بررسی کردیم و به‌دنبال SCAAهای مرتبط با APGها (روش‌ها) در ۲۵ CRC گشتیم. در مجموع ۴۵ SCAA شناسایی کردیم که همگی در نواحی پروموتور بالای این APGها بودند. از این ۳۴ APG، ۲۱ (۶۲٪) حداقل یک SCAA داشتند و ۹ از ۲۵ (۳۶٪) بیمار حداقل یک APG تحت تأثیر SCAA داشتند. به‌طور قابل‌توجه، ۴۲ (۹۳٪) از SCAAها کاهش دسترسی (loss) بودند که به‌طور معناداری متفاوت از انتظارات بر پایه توزیع سراسری SCAAها بود (P = 0.025؛ روش‌ها). هیچ‌یک از SCAAها همزمان با جهش‌های سوماتیک در همان ژن‌ها هم‌پدید نشد (شکل 2a). این انحصار می‌تواند نشان دهد که جهش‌ها بیشتر در ژن‌های بیان‌شده یافت می‌شوند یا اینکه SCAAها مسیر دیگری برای اختلال در ارائه آنتیژن هستند.

a، نقشه حرارتی SCAAها در APGها. مستطیل‌های آبی و قرمز نشان‌دهنده کاهش و افزایش دسترسی SCAA در نواحی پروموتور مرتبط با ژن هستند، با دات‌هایی که جهش‌های سوماتیک را نشان می‌دهند. b، نسبت شانس دو‑طرفه (OR) برای اینکه یک نوآنتیژن در مقایسه با یک جهش غیرآنتی‌ژنیک در یک ژن…

ویرایش ایمونولوژیک توسط SCAAها و تنظیم رونویسی

ما بررسی کردیم که آیا بازسازماندهی اپی‌ژنوم به‌طور ترجیحی نوآنتیژن‌ها را ساکن می‌کند؛ یعنی ویرایش اپی‌ژنتیکی ایمونولوژیک. دسترسی به کروماتین تمام نقاط ژنتیکی که جهش‌های تغییردهنده پروتئین در آن‌ها شناسایی شده بود، جمع‌آوری کردیم. نوآنتیژن‌ها در ژن‌هایی که SCAAها تمایل به بسته شدن کروماتین داشتند غنی‌تر بودند (نسبت شانس (OR) تست فیشری (نوآنتیژن و کاهش SCAA) = 1.46 (1.05–2.03)؛ شکل 2b)، و این مشاهده در سطح هر سرطان به‌صورت جداگانه نیز صادق بود (P = 0.017؛ شکل 2c). غنی‌سازی کاهش SCAA در سرطان‌های MMRd معنادار بود (OR تست فیشری (نوآنتیژن و کاهش SCAA) = 1.52 (1.03–2.27)) اما در MMRp نه؛ احتمالاً به‌دلیل کمبود توان آماری، زیرا توزیع نوآنتیژن‌ها و جهش‌های تحت تأثیر کاهش SCAA بین سرطان‌های MMRp و MMRd متفاوت نبود (χ²‑test P = 0.37). همچنین متوجه شدیم که کاهش‌های SCAA به‌طور معناداری بیشتر با نوآنتیژن‌ها نسبت به SNVهای غیرآنتی‌ژنیک مرتبط بودند (P = 0.0085؛ شکل داده‌های گسترش یافته 4a).

حذف و سرکوب ایمنی در سراسر نواحی تومور

سپس بررسی کردیم که ساختار و ترکیب میکرومحیط (TME) چگونه به فرار ایمنی کمک می‌کند. تجزیه و تحلیل کمی داده‌های CyCIF نشان داد که به‌طور کلی تومورها به‌طور معناداری از سلول‌های ایمنی خالی هستند (شکل 1c). نسبت لنفوسیت‌های سیتوتوکسیک CD8⁺ (CTLها) به‌طور معناداری در تومور سطحی و حاشیه تهاجمی نسبت به مخاط نرمال مجاور کمتر بود (P = 3 × 10⁻⁵ و P = 3 × 10⁻³، به ترتیب؛ شکل 3a) و CTLها در نواحی حاوی تومور از سلول‌های اپیتلیال فاصله بیشتری نسبت به مخاط نرمال داشتند (P < 10⁻¹⁶)؛ شکل 3b,c). فاصله بین CTL و سلول تومور در نواحی سطحی تومور بیشترین مقدار را داشت. علاوه بر این، سلول‌های تنظیمی FOXP3⁺ که CTLA‑4 را بیان می‌کنند (سلول‌های T_reg)، که عملکرد سرکوبی ایمنی دارند، در تمام نواحی تومور نسبت به مخاط نرمال غنی‌سازی شدند (P = 0.012، P = 0.01 و P = 6 × 10⁻³ برای تومور سطحی، حاشیه تهاجمی و گره؛ شکل 3d)، که با گزارش‌های قبلی همخوانی دارد²⁹.

a، تعداد سلول‌های سیتوتوکسیک T (a) و سلول‌های T_reg که CTLA‑4⁺ هستند (d) نسبت به سلول‌های اپیتلیال در هر تصویر CyCIF، گروه‌بندی بر اساس نوع نمونه. b، فاصله بین سلول‌های اپیتلیال و نزدیک‌ترین سلول سیتوتوکسیک T در نواحی مختلف نمونه (n = 66,809؛ 122,280؛ 180,485 و 124,762 در نرمال، سطحی، تهاجمی و گره، به ترتیب). c، تصاویر نمایشی CyCIF نشان‌دهنده سلول‌های اپیتلیال (قرمز) و سلول‌های سیتوتوکسیک T (سبز) در مخاط نرمال (i) و تومور سطحی (ii). نقاط در a و d نشان‌دهنده هر ROI به‌صورت فردی هستند. مقدار P مدل اثرات ترکیبی که بیمار را به‌عنوان اثر تصادفی در نظر می‌گیرد، در بالای a و d نشان داده شده است.

شیوع و پیامدهای فرار ژنتیکی ایمنی

سپس مسیر تکامل تغییرات فرار ژنتیکی ایمنی را بررسی کردیم. جهش‌های کلونال فرار ایمنی در ۸ از ۲۹ CRC شناسایی شد (شکل 1b و 4a,b و شکل داده‌های گسترش یافته 1) که در سه سرطان (C518، C524، C548؛ شکل 4c,d و شکل داده‌های گسترش یافته 1) تغییرات متعدد HLA در شاخه‌های مستقل درخت فیلوژنتیک آن‌ها مشاهده شد. این بروز موازی نشان‌دهنده انتخاب قوی برای فرار ایمنی³¹ است. زیرکلون‌های جزئی با تغییرات فرار ایمنی (تغییرات موجود در کمتر از ۲۵٪ نمونه‌های یک تومور) در چهار مورد دیگر (C537، C543، C547، C559؛ شکل 1b و شکل داده‌های گسترش یافته 1) شناسایی شدند. دو جهش HLA (در C524 و C537) نیز در حاشیه تهاجمی نمونه‌های FFPE‑PS متقارن تأیید شد.

a–d، درخت فیلوژنتیکی بازسازی‌شده با استفاده از داده‌های FF‑WGS بیمار C528 (a، MMRp)، C552 (b، MMRd)، C518 (c، MMRd) و C524 (d، MMRp). تغییرات فرار ایمنی با پیکان یا بر روی شاخه‌ای که رخ داده‌اند نشان داده شده‌اند، با رنگ‌هایی که همانند شکل 1b نشان‌دهنده جهش‌ها هستند. نمونه‌های رنگ‑پریده با توالی‌‏یابی کم‌پاس (low‑pass WGS) توالی‌‏یابی شده‌اند و با نمونه‌های عمیق‌تو

الی‑یابی ژنوتیپ شده‌اند. e، بار نسبی نمونه‌های CRA و CRC. f، مقادیر بار نسبی برای نمونه‌های MMRp، وفق وضعیت فرار ایمنی هر سرطان. g،h، تعداد سلول‌های PD‑1⁺ (g) و سلول‌های استرومال (h) به ازای هر سلول اپیتلیال در نمونه‌های MMRp FFPE‑PS، طبق وضعیت فرار ایمنی سرطان‑ایمنی. نقاط در e–h نشان‌دهنده ROI/بیوپسی‌ها هستند و مقدار P مدل اثرات ترکیبی که بیمار را به‌عنوان اثر تصادفی در نظر می‌گیرد، در بالای هر پنل نشان داده شده است.

تعاملات موضعی تومور‑ایمنی در حاشیه تهاجمی

سپس ما بر ویرایش ایمونولوژیک و ساختار میکرومحیط (TME) در حاشیه تهاجمی تمرکز کردیم. تجزیه و تحلیل کمی داده‌های CyCIF نشان داد که به‌طور کلی تومورها به‌طور معناداری از سلول‌های ایمنی خالی هستند (شکل 1c). نسبت لنفوسیت‌های سیتوتوکسیک CD8⁺ (CTLها) به‌طور معناداری در تومور سطحی و حاشیه تهاجمی نسبت به مخاط نرمال مجاور کمتر بود (P = 3 × 10⁻⁵ و P = 3 × 10⁻³، به ترتیب؛ شکل 3a) و CTLها در نواحی حاوی تومور از سلول‌های اپیتلیال فاصله بیشتری نسبت به مخاط نرمال داشتند (P < 10⁻¹⁶)؛ شکل 3b,c). فاصله بین CTL و سلول تومور در نواحی سطحی تومور بیشترین مقدار را داشت. علاوه بر این، سلول‌های تنظیمی FOXP3⁺ که CTLA‑4 را بیان می‌کنند (سلول‌های T_reg)، که عملکرد سرکوبی ایمنی دارند، در تمام نواحی تومور نسبت به مخاط نرمال غنی‌سازی شدند (P = 0.012، P = 0.01 و P = 6 × 10⁻³ برای تومور سطحی، حاشیه تهاجمی و گره؛ شکل 3d)، که با گزارش‌های قبلی همخوانی دارد²⁹.

a، نسبت لنفوسیت‌های نفوذی تومور (TIL) که با استفاده از تصاویر رنگ‌آمیزی H&E اندازه‌گیری شده، بر اساس نوع ROI مرتبط با تومور. b، نسبت سلول‌های اپیتلیال PD‑L1⁺ در تصاویر CyCIF در میان انواع مختلف نمونه. c، تصویر نمایشی CyCIF از غده توموری در حاشیه تهاجمی، که سلول‌های اپیتلیال PD‑L1⁺ را به رنگ آبی و سلول‌های سیتوتوکسیک T را به رنگ قرمز نشان می‌دهد. مرز غده توسط خط زرد مشخص شده است. d، فاصله سلول‌های اپیتلیال تا نزدیک‌ترین سلول سیتوتوکسیک T، برای سلول‌های اپیتلیال غیر‑PD‑L1 در CNهای غیر‑PD‑L1 و برای سلول‌های اپیتلیال PD‑L1⁺ در CNهای مرتبط با PD‑L1 (n = 158,547 و 4,459 برای سلول‌های غیر‑PD‑L1 و PD‑L1⁺ به ترتیب). e، تابع H ریپلی که ترکیب بین سلول‌های PD‑L1⁺ و PD‑1⁺ را در نواحی مختلف سرطانی می‌سنجد. مقادیر نزدیک به صفر (خط نقطه‌دار) نشان‌دهند ترکیب یکنواخت است. f، نسبت تمام نوآنتیژن‌های با ایمنی‌پذیری بالا و تمام جهش‌های غیرایمنی‌پذیر که در بازه 0.05 < VAF < 0.1 قرار می‌گیرند در n = ۲۹ نمونه حاشیه تهاجمی. هر خط مقادیر جفت‌دار استخراج‌شده از همان بیوپسی را نشان می‌دهد، با مقدار آزمون ویلکاکسون جفت‌دار دو‑طرفه P در بالای پنل نمایش داده شده است. نقاط در a، b و e نمایانگر ROI/بیوپسی‌ها هستند و مقدار P مدل اثرات ترکیبی که بیمار را به‌عنوان اثر تصادفی در نظر می‌گیرد، در بالای b نشان داده شده است.

بحث

در این کار، ما تعامل فرآیندهای اپی‌ژنتیک، ژنتیک و میکرومحیطی را که به‌طور جمعی فرار ایمنی را ایجاد و تکامل همگرایی تومور‑ایمنی را در CRC شکل می‌دهند، نقشه‌برداری کردیم. تجزیه و تحلیل‌های ما نشان می‌دهد که فرار ایمنی بخشی از «انفجار بزرگ» است که CRCها را شکل می‌دهد³⁹، که سپس ایمونژنیکت کلی کل سرطان را تعیین می‌کند.

ما دریافتیم که SCAAها به کاهش بیان ژن‌های حامل نوآنتیژن و ژن‌های مرتبط با ارائه آنتیژن کمک می‌کنند. چندین فاکتور رونویسی (TF) را به‌عنوان تنظیم‌کنندگان احتمالی APGها از طریق کاهش‌های SCAA شناسایی کردیم. به‌ویژه، سایت‌های اتصال NFIC تمام APGهای تحت تأثیر SCAA را پوشش می‌دهند، هرچند تأیید عملکردی آن به‌عنوان هدف تجربی برای تنظیم ایمنی در CRC ضروری است. خوش‌بینانه، NFIC به‌تازگی در پاسخ به ایمونوتراپی در زیرگروه بیماران سرطانی ریه نشان داده شده است که ساکن‌سازی آن منجر به فنوتیپ فرار ایمنی می‌شود⁴⁰.

ما دریافتیم که تغییرات ایمونژنیک به‌طور ترجیحی در سطح رونویسی توسط (تا کنون نامشخص) مکانیزم‌های اپی‌ژنتیک ساکن می‌شوند، که به‌خصوص برای کنترل نوآنتیژن‌های کلونال که احتمالاً انتخاب ایمنی بر آن‌ها اثر می‌گذارد، اهمیت دارد^41,42. نتایج ما با مشاهدات پیشین که نشان می‌دهند عوامل اپی‌ژنتیک و محیطی نقش قابل‌ملاحظه‌ای در تعیین پیش‌آگهی سرطان، حساسیت ایمنی و پاسخ به ایمونوتراپی دارند، همسو است^20,43,44,45. در نتیجه، نقشه‌برداری اپی‌ژنوم می‌تواند بیماران با پتانسیل پایین یا بالای پاسخ به ایمونوتراپی را شناسایی کند؛ مطالعات بزرگ‌مقیاس مورد نیاز است. به‌طور عملی، داروهای تغییر‌دهنده اپی‌ژنوم یا فعالیت فاکتورهای رونویسی انتخاب‌شده می‌توانند تأثیر عمیقی بر ارائه نوآنتیژن داشته و احتمالاً با داروهای ایمونوتراپی هم‌افزا شوند. این امر نیاز به کارهای آینده بر روی اعتبارسنجی هدف‌های اپی‌ژنتیک در مدل‌های کوا-کشت‌دهی مشتق‌شده از بیماران همچون ارگانوییدها دارد⁴⁶.

اگرچه ناهمگنی در بار نوآنتیژن و ترکیب میکرومحیط ایمنی وجود دارد، ما مشاهده کردیم که ویژگی‌های کلونال برای تعیین ایمونژنیک بودن مهم‌ترین هستند. ما دریافتیم که به‌دست آوردن تحمل ایمنی قبل یا حین گسترش اولیه کارسینوم رخ می‌دهد، زیرا بازسازی میکرومحیط در تمام نواحی مرتبط با تومور شایع بود، همراه با تغییرات ژنتیکی فرار ایمنی با تأثیر بالا و فرآیندهای اپی‌ژنتیک برای تضمین کاهش ارائه نوآنتیژن و فعال‌سازی ایمنی. این منجر به یک هم‌تکامل «انفجار بزرگ» بین تومور‑ایمنی می‌شود که تغییرات سوماتیک پیش از گسترش و ویژگی‌های TME بار نوآنتیژن کلونال این سرطان‌ها را تعیین می‌کند و مسیر تکامل را تعیین می‌کند، در حالی که نیروهای انتخابی (ساب‌کلونال) نقش ضعیفی ایفا می‌کنند. این با کار قبلی ما که تغییر در ایمونژنیکیت پیش از گسترش کارسینوما را نیز برجسته کرد، همخوانی دارد¹⁴. به‌طور کلی، این داده‌ها نشان می‌دهند که پس از گسترش اولیه، CRC دیگر در یک «جنگ تمام‌عیار» با سیستم ایمنی درگیر نیست. ما کشف کردیم که «نبردهای» جاری تعامل سرطان‑ایمنی محدود به زیرکلون‌های کوچک موضعی در طول حاشیه تهاجمی CRCهای MMRp است، جایی که تصور می‌کنیم ترکیب میکرومحیط ایمنی به طور قابل‌توجهی تغییر می‌کند و بنابراین ویرایش ایمونولوژیک برجسته‌تری رخ می‌دهد. این زیرکلون‌ها با تعامل پیچیده‌ای از